2、加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
3、 PCR擴增（核酸擴增區(qū)）
3.1  將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；
3.2  設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。
3.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

4、結(jié)果分析判定
4.1  結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值（一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）、stop值（一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及Threshold的Value值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結(jié)果。
4.2  結(jié)果判斷
陽性：檢測通道Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；
可疑：檢測通道35值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為35值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。
5、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無Ct值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。